總蛋白提取試劑盒注意事項
1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！
檢測方法
WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等
總蛋白提取試劑盒產(chǎn)品特點
1.使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。
2.提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。
3.含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
4.紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5.總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
產(chǎn)品應(yīng)用
WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等
儀器準備
1.離心機
2.振蕩器
3.勻漿機/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
使用注意事項
?旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
?蛋白酶抑制劑在2-8℃時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
?實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
?蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
?如果試劑盒不能短時間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
?可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
?下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，提取液可以不加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，注意提取過程保持低溫操作，縮短離心時間。
?Western Blot實驗內(nèi)參可以選用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
離心機轉(zhuǎn)速有相對離心力（RCF，×g）和每分鐘轉(zhuǎn)速（RPM，r/min）兩種表示方式，有些離心機設(shè)置有RPM和×g顯示切換，但部分離心機沒有自動切換功能。需要用下面的公式進行換算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 為有效離心半徑，即從離心機軸心到離心收集管底部中心位置的長度，單位為厘米) 例如: 轉(zhuǎn)速為3000rpm，有效離心半徑為10 cm，則相對離心力（RCF，×g）為=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
使用方法
細胞樣本總蛋白提?。?br/>懸浮細胞蛋白提?。?br/>1. 提取液準備：
每500 μl冷的總蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物和2 μl磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5×106個細胞，在4℃，2500×g條件下離心5分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每5×106 -1×107個細胞（大約50 mg細胞/50 μl細胞沉淀體積）中加入500 μl冷的總蛋白提取液，吹打混勻后，在4℃條件下振蕩20-30分鐘，至細胞充分裂解，無明顯細胞沉淀。
5. 在4℃，12000×g條件下離心15分鐘。
6. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
7. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?br/>
貼壁細胞蛋白提?。?br/>1. 提取液準備：
每500 μl冷的總蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物和2 μl磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 小心吸取貼壁細胞的培養(yǎng)液。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干PBS。
4. 加入適量冷的總蛋白提取液，振蕩15-30分鐘，至細胞充分裂解，用細胞刮刀刮一遍，將裂解液吸入另一干凈離心管。
5. 在4℃，12000×g條件下離心15分鐘。
6. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即得到總蛋白。
7. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?br/>組織樣本總蛋白提取：
1. 提取液準備：
每500 μl冷的總蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物和2 μl磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取50-100 mg組織樣本，用PBS洗干凈，然后用刀盡可能剪碎，加入500 μl總蛋白提取液，用組織勻漿器/勻漿機勻漿至無明顯肉眼可見固體。
3. 將組織勻漿吸入一預(yù)冷的干凈離心管中，在4℃條件下振蕩10-20分鐘。
4. 在4℃，10000-14000×g條件下離心15分鐘。
5. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即得到總蛋白。
6. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?br/>
常見問題分析
1.蛋白濃度低？
處理部分組織樣本時可能沒有裂解，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
2.細胞裂解速度慢？
為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用的保護蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應(yīng)用范圍廣。適當延長裂解的時間即可。
3.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準。如果已經(jīng)進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
4.提取時出現(xiàn)膠狀沉淀？
蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗即可；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。
5.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。
參考文獻
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Journal of Proteomics 2012 （IF=5.074）
產(chǎn)品型號：BB-31334
